分子熒光分光光度計的熒光強度容易受外界因素的影響,如樣品池、激發(fā)光源、溫度、溶液的pH值、溶劑性質(zhì)、其它溶質(zhì)、表面活性劑等都會(huì )造成熒光強度的變化。嚴格控制測試條件對熒光分析來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。
1.樣品應盛在四面透光的石英比色皿(熒光池)中,如果是揮發(fā)性樣品應使用帶塞的熒光池。
2.熒光分析時(shí),為了得到穩定可靠的數據,一般需要開(kāi)機預熱氙燈大約30min。如果儀器光源采用的是閃爍氙燈,預熱時(shí)間可以縮短到10min左右。對某些易感光、易分解的熒光物質(zhì),盡量采用長(cháng)波長(cháng)、低人射光強度及短時(shí)間光照。
3.溫度變化可引起熒光強度的改變。通常降低溫度,有利于提高熒光量子產(chǎn)率,熒光強度增大。溫度影響熒光強度的顯著(zhù)程度因樣品而異,大部分熒光物質(zhì)的熒光強度受溫度影響不大,測試溫度變化不超過(guò)±3℃,對測試結果幾乎無(wú)影響。
4.當熒光物質(zhì)是弱酸或弱堿時(shí),溶液的pH對熒光強度有較大影響。因為弱酸或弱堿在不同酸度中,分子和離子的電離平衡會(huì )發(fā)生改變,而熒光物質(zhì)的熒光強度會(huì )因其離解狀態(tài)發(fā)生改變。
5.分子結構中存在π-π共軛的熒光物質(zhì)在極性溶劑中,熒光效率顯著(zhù)增強。溶液中表面活性劑的加入能夠顯著(zhù)提高熒光強度。
6.瑞利散射和拉曼散射是溶劑的兩種散射光,應注意不要誤把瑞利散射和拉曼散射光譜當做熒光光譜。瑞利散射光波長(cháng)與激發(fā)光波長(cháng)相同,拉曼散射與激發(fā)光波長(cháng)不同,而熒光物質(zhì)的熒光波長(cháng)與激發(fā)光波長(cháng)無(wú)關(guān),因此可以通過(guò)選擇適當的激發(fā)波長(cháng)將拉曼散射光與熒光分開(kāi)。在測試時(shí)選擇合適的狹縫寬度,或者空白扣除,也可以對散射光的影響進(jìn)行校正。
7.熒光物質(zhì)分子與溶液中其它物質(zhì)分子之間作用導致熒光強度降低,常見(jiàn)的熒光猝滅劑,如鹵素離子、重金屬離子、硝基化物質(zhì)、重氮化合物等。溶液中的溶解氧也能引起幾乎所有的熒光物質(zhì)產(chǎn)生不同程度的熒光熄滅現象,因此,在較嚴格的熒光實(shí)驗中必須除02。
8.測試過(guò)程中注意不要肉眼盯著(zhù)氙燈光源看,以防對眼睛造成損傷。
9.分子熒光分光光度計工作室內應注意經(jīng)常通風(fēng),避免產(chǎn)生的臭氧在室內富集。